一、污染來(lái)源

　　細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中污染的來(lái)源主要有以下幾條途徑：

　　1、不潔的動(dòng)物組織標(biāo)本

　　很多動(dòng)物組織本該是無(wú)菌的（直接與外界相通的呼吸道和消化道、泌尿系統(tǒng)除外），但由于取材時(shí)不小心也會(huì)有污染的機(jī)會(huì)。組織本身含有細(xì)菌，如取材時(shí)不用濃的抗生素洗液洗滌浸泡，也會(huì)帶菌，造成細(xì)胞污染。

　　2、空氣

　　空氣中含有大量的微生物，如果操作室與外界隔離不嚴(yán)或消毒不充分下，很容易造成污染。另外，凈化工作臺(tái)使用過(guò)久，濾板未定期更換或長(zhǎng)久不更換，濾氣受塵埃堵塞，工作時(shí)不帶口罩或外界氣流過(guò)強(qiáng)，污染空氣進(jìn)入操作區(qū)，也會(huì)導(dǎo)致污染。春夏季南方地區(qū)多雨，空氣濕度大，含菌量多，工作不注意也易造成污染。

　　3、清洗消毒

　　培養(yǎng)用物品、材料洗刷不凈，培養(yǎng)用液和器材滅菌不*也會(huì)引入微生物和有毒物質(zhì)。

　　4、操作

　　來(lái)自操作者的污染主要有以下幾方面：

　?。?）器材和溶液使用前未仔細(xì)檢查是否污染過(guò)，或者是否已經(jīng)消毒滅菌處理過(guò)，或者雖經(jīng)處理，時(shí)隔已久又末重新處理。

　?。?）操作者未戴口罩、帽子，呼出氣中排出細(xì)菌和支原體。

　?。?）培養(yǎng)瓶口未用75%酒精擦和燒灼。

　　（4）操作者不當(dāng)心，動(dòng)作不正確而將吸管或無(wú)菌器具碰到了污染的物品，如手上皮膚和瓶子外壁等。

　　（5）操作者操作時(shí)大聲說(shuō)話，來(lái)回走動(dòng)揚(yáng)起灰塵等。

　　5、血清

　　市售血清滅菌不*，潛在病毒和支原體污染。

　　二、污染的鑒別

　　1、細(xì)菌、真菌污染的檢測(cè)

　?。?）肉眼觀察細(xì)菌、真菌污染常在傳代、換液、加樣等開(kāi)放性操作之后發(fā)生，而且增生迅速，若有污染，在48小時(shí)內(nèi)可明顯觀察到。如培養(yǎng)液變混濁，或略加振蕩有很多漂浮物漂起。

　?。?）鏡下觀察在倒置顯微鏡的高倍鏡下可見(jiàn)培養(yǎng)液中有大量圓球狀顆粒漂浮，即為細(xì)菌污染。若細(xì)胞之間有絲狀、管狀、樹(shù)枝狀或卵形的物質(zhì)常為真菌污染。

　　（3）接種觀察采用普通肉湯接種或用未加雙抗藥物的培養(yǎng)液接種，也可發(fā)現(xiàn)是否有污染。

　　2、支原體污染的檢測(cè)

　?。?）相差顯微鏡觀察將細(xì)胞接種于事先放置于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的支持物（一般用長(zhǎng)形蓋玻片），24小時(shí)后用清潔塵鑷子從培養(yǎng)瓶中取出支持物，細(xì)胞面向上放置于載物片上，再蓋上較大蓋玻片，用相差油鏡觀察；若不用支持物培養(yǎng)法，直接取少許培養(yǎng)液滴在載物片上，再蓋上蓋片觀察亦可。支原體在鏡下呈暗色微小顆粒，多位于細(xì)胞與細(xì)胞之間，有時(shí)可見(jiàn)類(lèi)似于布朗運(yùn)動(dòng)的表現(xiàn)。應(yīng)注意與細(xì)胞破碎溢出的內(nèi)容物如線粒體等相區(qū)別。

　?。?）低漲處理地衣紅染色觀察取已在培養(yǎng)瓶中的支持物蓋片或培養(yǎng)液，用新鮮配制的0.5%枸椽酸溶液處理蓋片細(xì)胞。用新配制的Carnoy液固定兩次，每次10分鐘，取出蓋片涼干。用培養(yǎng)液時(shí)，先吸取1mL，500～800r/min離心5分鐘后去除上清，留0.2mL，將0.5%枸椽酸溶液加入其中，置10分鐘，加入Carnoy液固定，離心棄上清固定液，余0.2mL沉淀物，制成2～3張涂片。然后用2%醋酸依地紅（地衣紅2g，冰醋酸60mL，加蒸餾水至100mL）染5分鐘。純酒精過(guò)三次，每次1分鐘，封入Euparal或樹(shù)膠中。若染色過(guò)深，可先用75%酒精脫色，再封片。鏡下觀察見(jiàn)支原體呈暗紫色小點(diǎn)，位于細(xì)胞外或細(xì)胞之間。

　?。?）熒光染色法觀察用熒光染料Hoechst33258，此染料能與DNA特異地結(jié)合，可使支原體內(nèi)的DNA著色，然后用熒光顯微鏡觀察。染色方法為：用支持物蓋片培養(yǎng)法將細(xì)胞接種在蓋片上，在細(xì)胞匯合前（即未長(zhǎng)滿前）取出玻片，于碟皿中，用不含酚紅的Hanks液漂洗，1:3醋酸鉀固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后置于50μg/mL的Hoechst33258（生理鹽水配制）中染色10分鐘，置于蒸餾水漂洗1～2分鐘，向細(xì)胞面滴加數(shù)滴pH5.5磷酸緩沖液，然后置熒光顯微鏡下觀察。若用細(xì)胞培養(yǎng)液，先離心去除上清液，再加入Hanks液漂洗，離心棄上清后加入1:3醋酸甲醇固定10分鐘，再用生理鹽水漂洗后去上清液，再用Hoechst33258染色10分鐘，加入蒸餾水漂洗，離心去上清蒸餾水，加3～5滴pH5.5磷酸緩沖液，稍吹打使沉淀細(xì)胞重懸浮，用吸管吸出，滴于載物片上，蓋上蓋片后觀察。熒光顯微鏡下支原體呈綠色小點(diǎn)，散在于細(xì)胞周?chē)蚋接诩?xì)胞表面。

　?。?）電鏡檢測(cè)若條件許可，可用掃描電鏡或透射電鏡觀察。一般在細(xì)胞培養(yǎng)48～72小時(shí)，細(xì)胞接近匯合前，用胰酶消化細(xì)胞制成細(xì)胞懸液后進(jìn)行。需經(jīng)過(guò)固定、包埋、切片后才能進(jìn)行觀察。詳細(xì)方法同細(xì)胞形態(tài)觀察法（見(jiàn)第九章）。

　?。?）培養(yǎng)檢測(cè)將2.5×109/L細(xì)胞懸液5mL加入45mL支原體肉湯培養(yǎng)基（Sigma或北京生物制品所生產(chǎn)的均可），培養(yǎng)14天后觀察肉湯培養(yǎng)有無(wú)霧狀沉淀，然后取0.5ml加入已冷卻到50℃的培養(yǎng)基中，再用瓊脂培養(yǎng)基做分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)3天觀察有無(wú)“荷包蛋”菌落出現(xiàn)。細(xì)胞培養(yǎng)污染