ELISA檢測試劑盒中一般有3次加樣步聚，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物，加底物。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA試劑盒板孔的底部，避免加在孔壁上部，并留意不行濺起，不行產(chǎn)生氣泡。

在ELISA試劑盒中一般有兩次抗原抗體反響，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后。抗原抗體反響的完結(jié)需要有一定的溫度和時刻，這一保溫進(jìn)程稱為溫育（incubation），有人稱之為孵育，在ELISA中似不恰當(dāng)。

加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)則的量參加板孔中。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴，避免發(fā)作交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣。有此測定（如間接法ELISA）需用稀釋的血清，可在試管中按規(guī)則的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中參加稀釋液，ELISA試劑盒再在其間參加血清標(biāo)本，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保 證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器，使加液進(jìn)程迅速完結(jié)。
ELISA屬固相，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)作。

以抗體包被的夾心法為例，參加板孔中的標(biāo)本，其間的抗原并不是都有平等的和固相抗結(jié)合的時機(jī)，只要貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體觸摸。這是一個逐步平衡的進(jìn)程，因而需經(jīng)分散才能達(dá)到反響的結(jié)尾。在其后參加的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此。這便是為什么ELISA反響總是需要一定時刻的溫育。

溫育常選用的溫度有43℃、37℃、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度。在建立ELISA試劑盒辦法作反響動力學(xué)研究時，實驗標(biāo)明，兩次抗原抗體反響一般在37℃經(jīng)1-2小時，ELISA檢測試劑盒產(chǎn)物的生成可達(dá)。為加速反響，可提高反響的溫度，有些實驗在43℃進(jìn)行，但不宜選用更高的溫度?？乖贵w反響4℃更為*，在放射免疫測定中多使反響在冰箱中，以構(gòu)成多的沉淀。但因所需時刻太長，在ELISA中一般不予選用。